מצוות עשה מהתורה שהכהנים יברכו את ישראל, שנאמר (במדבר ו, כב-כז): "וַיְדַבֵּר ה' אֶל מֹשֶׁה לֵּאמֹר. דַּבֵּר אֶל אַהֲרֹן וְאֶל בָּנָיו לֵאמֹר, כֹּה תְבָרֲכוּ אֶת בְּנֵי יִשְׂרָאֵל אָמוֹר לָהֶם. יְבָרֶכְךָ ה' וְיִשְׁמְרֶךָ. יָאֵר ה' פָּנָיו אֵלֶיךָ וִיחֻנֶּךָּ. יִשָּׂא ה' פָּנָיו אֵלֶיךָ וְיָשֵׂם לְךָ שָׁלוֹם. וְשָׂמוּ אֶת שְׁמִי עַל בְּנֵי יִשְׂרָאֵל וַאֲנִי אֲבָרֲכֵם".
מצווה זו נוהגת בכל יום, וכל כהן שקראו לו לעלות לדוכן לברך את ישראל וסרב, אף שמצד הדין הוא מבטל מצווה אחת בלבד, נחשב לו הדבר כאילו ביטל שלוש מצוות מן התורה. משום שמלשון הפסוקים משמע שהקב"ה מתאווה לברך את ישראל, ולכן שלוש פעמים נזכר לשון ציווי וזירוז לכהנים לברך את ישראל, שנאמר: "כֹּה תְבָרֲכוּ, אָמוֹר לָהֶם, וְשָׂמוּ אֶת שְׁמִי". לפיכך סירובו של הכהן לקיים את רצון הבורא ולברך את ישראל, נחשב כביטול שלוש מצוות מן התורה (סוטה לח, ב; רמב"ם תפילה טו, יב).
ואף אם כבר ברך פעם אחת באותו יום את ישראל, אם קראו לו במניין אחר לעלות לדוכן, מצווה שיעלה ויברך פעם נוספת. אבל אם לא עלה, אינו מבטל מצוות עשה מהתורה (שו"ע קכח, ג).
כתב בספר חרדים (יב, יח) חידוש חשוב, שלא הכהנים בלבד מקיימים מצווה מהתורה בברכת כהנים, אלא אף הישראלים העומדים מולם בשתיקה ובכוונה, ועונים אמן אחר ברכתם, שותפים בקיום מצוות התורה.
בברכת כהנים אנו לומדים לשים לב לעובדה היסודית, שהקב"ה הוא המעניק לנו את הברכה, וההתייצבות שלנו בכל יום לברכת כהנים, משרישה בקרבנו את האמונה הזו (מו"נ ח"ג פרק מד; העקדה שער עד). וככל שנהיה מודעים יותר לעובדה שהקב"ה הוא המברך את עמו ישראל באהבה, כך נהיה פתוחים ומוכנים יותר לקבל את הברכה (עיין בחינוך שעח). הבחירה החופשית היא יסוד העולם, ולכן הברכה שהקב"ה מברך אותנו קשורה להשתדלות מצידנו. או כפי שהדבר מתבטא בלשון הקבלה: "באתערותא דלתתא תליא אתערותא דלעילא", כלומר על-ידי התעוררות הרצון שלנו לקבל את ברכתו, מתעורר רצון עליון להשפיע ברכה לישראל. על ידי קיום מצוות ברכת כהנים, עם ישראל מבטא את רצונו לקבל את הברכה האלוקית.
