מצוות עשה לשבות ביום הכיפורים מכל מלאכה, שנאמר (ויקרא כג, לב): "שַׁבַּת שַׁבָּתוֹן הוּא לָכֶם". וכל העושה מלאכה ביום הכיפורים, בנוסף לכך שביטל מצוות 'עשה' עבר על 'לא תעשה', שנאמר (שם כג, כח): "וְכָל מְלָאכָה לֹא תַעֲשׂוּ". לפיכך, כל שלושים ותשע המלאכות האסורות בשבת אסורות ביום הכיפורים. והעושה מלאכה במזיד – חייב כרת, ובשוגג – חייב חטאת. ורק לעניין אחד יש הבדל בין שבת ליום הכיפורים, שהעושה מלאכה במזיד בפני עדים שהתרו בו, בשבת חייב סקילה, וביום הכיפורים חייב כרת, שנאמר (שם כג, ל): "וְכָל הַנֶּפֶשׁ אֲשֶׁר תַּעֲשֶׂה כָּל מְלָאכָה בְּעֶצֶם הַיּוֹם הַזֶּה וְהַאֲבַדְתִּי אֶת הַנֶּפֶשׁ הַהִוא מִקֶּרֶב עַמָּהּ" (רמב"ם הל' שביתת העשור א, א-ב; שו"ע תריא, ב).
כמו בשבת גם ביום הכיפורים המצווה לשבות מחייבת גם שלא נעשה את יום הכיפורים כיום חול. כלומר, בנוסף לאיסור מלאכה מצווה גם לשבות מטורח ועמל, שלא יפתח אדם חנות, ולא יעסוק בהובלת משאות לקראת מלאכת ימי החול. ואף שהעושה כן אינו עובר על אחת מל"ט המלאכות, הוא מבטל את המצווה לשבות ביום הכיפורים, שנאמר (שם כג, לב): "שַׁבַּת שַׁבָּתוֹן הוּא לָכֶם", הרי שמצווה לשמור על קדושת היום וצביונו, שהילוכו ודיבורו לא יהיו כביום חול (פנה"ל שבת כב, א). זה הכלל: כל דיני שבת חלים ביום הכיפורים, ונוספה עליהם ביום הכיפורים המצווה להתענות, ועל כן יש בו יותר שביתה ופרישה מענייני העולם.
