תקנו חכמים תפילה נוספת לקראת סיום הצום, לפי שכל המרבה בתפילה נענה. ואם לא זכינו להיענות בתפילות הרגילות אולי נזכה להיענות בתפילה הנוספת. וקראו לתפילה זו ‘נעילה’, מפני שהיא לקראת הזמן שבו היו נועלים את שערי ההיכל בסיום עבודת היום במקדש, והיא גם כנגד נעילת שערי שמיים, שבסיום היום קדושת יום הכיפורים מסתלקת, ושערי שמיים שהיו פתוחים בפני הדופקים בתשובה ננעלים.
זמן נעילה הוא כשהחמה נראית בראש האילנות שבמערב, כארבעים דקות בערך לפני השקיעה. והרוצים להתחיל שעה לפני השקיעה רשאים. וצריך החזן לתכנן את תפילתו כך שיסיימו את ברכת כהנים לפני השקיעה (כמבואר בהלכה הקודמת).
אף ששערי ההיכל היו ננעלים בשקיעת החמה, שערי שמיים ננעלים בסיום היום, לאחר שכל האור של היום הקודם נאסף ומסתלק, ולכן מוסיפים לומר תפילות ותחנונים עד צאת הכוכבים. ומי שמאריך בתפילת נעילה עצמה עד אחר צאת הכוכבים אין מוחים בידו.[15]
נוסח תפילת נעילה שונה משאר תפילות הימים הנוראים, שבכל המקומות שמבקשים בלשון ‘כתיבה’, בתפילת נעילה מבקשים בלשון ‘חתימה’, מפני שהיא מתקיימת לקראת סוף יום הכיפורים בזמן חיתום הדין. ואם טעה ואמר לשון ‘כתיבה’ – יצא.
נכון לאדם להתאמץ מאוד בתפילת נעילה, כי תכלית עשרת ימי תשובה הוא יום הכיפורים, ותכלית יום הכיפורים הוא תפילת נעילה, שהכל הולך אחר החיתום, ואם לא עכשיו אימתי. ולכן גם מי שנחלש מחמת התענית, יאזור כגיבור חלציו להתפלל במחשבה זכה וברורה ולקבל על עצמו לשוב בתשובה, ולהתחזק בלימוד התורה וקיום המצוות (מ”ב תרכג, ג). לרוב חשיבותה של תפילת נעילה, נוהגים לפתוח את ארון הקודש מתחילת חזרת הש”ץ ועד לקדיש שבסיום התפילה (מטה אפרים תרכג, ז).