מצוות עשה מהתורה שהכהנים יברכו את ישראל, שנאמר (במדבר ו, כב-כו): "וַיְדַבֵּר ה' אֶל מֹשֶׁה לֵּאמֹר. דַּבֵּר אֶל אַהֲרֹן וְאֶל בָּנָיו לֵאמֹר, כֹּה תְבָרֲכוּ אֶת בְּנֵי יִשְׂרָאֵל אָמוֹר לָהֶם: יְבָרֶכְךָ ה' וְיִשְׁמְרֶךָ. יָאֵר ה' פָּנָיו אֵלֶיךָ וִיחֻנֶּךָּ. יִשָּׂא ה' פָּנָיו אֵלֶיךָ וְיָשֵׂם לְךָ שָׁלוֹם".
בברכת כהנים אנו לומדים לשים לב לעובדה היסודית, שהקב"ה הוא המעניק לנו את הברכה, וההתייצבות שלנו לברכת כהנים, משרישה בקרבנו את האמונה הזו (מו"נ ח"ג פרק מ"ד; חינוך שעח; העקדה שער עד). הברכה שהקב"ה מברך אותנו קשורה להשתדלות מצידנו. או כפי שהדבר מבואר בלשון הקבלה: "באתערותא דלתתא תליא אתערותא דלעילא", ותרגומו: בהתעוררות מלמטה תלויה ההתעוררות מלמעלה. כלומר על-ידי התעוררות הרצון שלנו במצוות ברכת כהנים לקבל את ברכתו, מתעורר רצון עליון להשפיע ברכה לישראל.
בזמן שבית-המקדש היה קיים, היו הכהנים מברכים ברכת כהנים לאחר סיום עבודת הקרבנות. וכך נאמר בתורה על היום השמיני של חנוכת המשכן, היום בו התחילו הכהנים לעבוד במשכן: "וַיִּשָּׂא אַהֲרֹן אֶת יָדָיו אֶל הָעָם וַיְבָרְכֵם, וַיֵּרֶד מֵעֲשֹׂת הַחַטָּאת וְהָעֹלָה וְהַשְּׁלָמִים" (ויקרא ט, כב). מכאן שנשיאת כפיים נעשתה בסיום עבודת הקרבנות. וטעם הדבר, שאחר הקרבת הקרבנות, שמבטאים את הנכונות שלנו להתבטל ולמסור את נפשנו לה' יתברך, אנו ראוים לקבל את ברכתו.
ושלא במקום המקדש, קבעו חכמים שברכת כהנים תיאמר בעת התפילה, משום שהתפילה והקרבנות נועדו למטרה אחת, להתקרב לפני האלוהים, ולכן תקנו את התפילות כנגד הקרבנות. וכמו שאחר הקרבת הקרבנות ברכו הכהנים, כך תקנו שלקראת סיום תפילת שמונה עשרה יברכו הכהנים.