כמו במוצאי שבת גם במוצאי יום טוב מצווה להיפרד מהחג בהבדלה, כלומר לציין בדיבור את ההבדל שבין קדושת החג לימי החול. וגם כאשר עוברים מיום טוב לחול המועד – מצווה להבדיל. דין ההבדלה כדין הקידוש, שכשם שצריך להזכיר את קדושת החג גם בתפילה וגם על הכוס, כך בצאת החג אומרים את נוסח ההבדלה גם בתפילה וגם על הכוס. בתפילה אומרים את נוסח ההבדלה באמירת 'אתה חוננתנו' בברכה הרביעית של תפילת ערבית.
תקנו חכמים שלא לעשות מלאכה לפני אמירת 'אתה חוננתנו' ושלא לאכול לפני הבדלה על הכוס. מי ששכח לומר 'אתה חוננתנו' יוצא בהבדלה שאומרים על הכוס, שלאחריה מותר לו לעשות מלאכה ולאכול. וכן נשים שאינן נוהגות להתפלל ערבית, יוצאות בהבדלה שעל הכוס. אשה שרוצה לעשות מלאכה לפני הבדלה על הכוס, תאמר: "ברוך המבדיל בין קודש לחול" ובכך תקיים את ההבדלה בדיבור, ויהיה מותר לה לעשות מלאכה. וכן דינו של איש שמתאחר בתפילת ערבית ובינתיים רוצה לעשות מלאכה, או מי ששכח לומר בתפילה 'אתה חוננתנו' והוא רוצה לעשות מלאכה לפני ההבדלה על הכוס.
שני הבדלים ישנם בין הבדלה של שבת להבדלה של חג:
א) במוצאי שבת מברכים על הבשמים, מפני שלאחר שהשבת יוצאת הנשמה היתירה מסתלקת והנפש דואבת, וכדי להשיב את רוחה מריחים בשמים. אבל בחג שאין בו נשמה יתירה כבשבת, אין צורך לנחם כל כך את הנפש, ולכן אין מברכים על הבשמים. ב) רק במוצאי שבת מצווה לברך על הנר, מפני שהאש נבראה במוצאי שבת (שו"ע תצא, א; מ"ב ב-ג).
נמצא אם כן שבהבדלה שבמוצאי החג אומרים שתי ברכות בלבד: ברכת היין וברכת ההבדלה.
במוצאי שבת נוהגים הכל לומר פסוקי ברכה לפני ברכות ההבדלה, מפני שהוא זמן מיוחד של המשכת ברכה לששת ימי המעשה. אבל במוצאי חג שאין בו סגולה מיוחדת זו, מנהג אשכנזים שלא לומר את פסוקי הברכה, ומנהג ספרדים לאומרם.