כך היה סדר המצווה: נכנס לקודש הקודשים עם מחתה של גחלים וכף של קטורת, ובקודש הקודשים חפן את הקטורת ונתנה על הגחלים, והיה העשן עולה ומתמר ומתפשט בקודש הקודשים עד אשר כיסה את הכפורת שעל ארון העדות. שנאמר (ויקרא טז, יב-יג): "וְלָקַח מְלֹא הַמַּחְתָּה גַּחֲלֵי אֵשׁ מֵעַל הַמִּזְבֵּחַ מִלִּפְנֵי ה', וּמְלֹא חָפְנָיו קְטֹרֶת סַמִּים דַּקָּה, וְהֵבִיא מִבֵּית לַפָּרֹכֶת. וְנָתַן אֶת הַקְּטֹרֶת עַל הָאֵשׁ לִפְנֵי ה', וְכִסָּה עֲנַן הַקְּטֹרֶת אֶת הַכַּפֹּרֶת אֲשֶׁר עַל הָעֵדוּת וְלֹא יָמוּת". הרמז בכך, שאפילו הקדוש שבישראל, אינו יכול להשיג בדעתו את העניין האלוקי כפי שהוא, ורק על ידי העשן והערפל – השכינה שורה, ומתוך הערפל העניין האלוקי הולך ומתגלה. לכן היה הכהן הגדול צריך להעלות תחילה קטורת בקודש הקודשים, ורק לאחר שקודש הקודשים התמלא בעשן, קיים את מצוותו (יומא נג, א).
כיוון שהקטורת מבטאת את הקשר העמוק שבין נשמות ישראל לה', היתה מחתת הקטורת נשארת בקודש הקודשים עד סיום עבודות היום, ובכל אותה העת היה עשנה נמשך ועולה. ובסיום עבודות היום היה הכהן הגדול נכנס בשם כל ישראל לקודש הקודשים, נפרד ונוטל את המחתה ויוצא.
שיעור הקטורת שהיה מקטיר בקודש הקודשים היה כשיעור מלא חופניו, לא יותר ולא פחות (שם מח, א), לרמוז שכל כוונתו ופועלו של הכהן הגדול היו מוקדשים לכלל ישראל. אמרו חכמים, שמלאכה זו של חפינת הקטורת מהכף אל תוך ידיו בלא שייפול פירור ארצה, היתה מהקשות שבמקדש (שם מט, ב). הרמז בכך, שצריך הכהן הגדול להתאמץ לקשר את כל הכוחות שבישראל אל קודש הקודשים בלא לאבד אפילו ניצוץ אחד.
הקטורת שהיו מקטירים בכל יום, היתה נכתשת היטב כדי שתהיה דקה, ומעלה יתירה היתה בקטורת שהיה הכהן הגדול מקטיר בקודש הקודשים, שהיו חוזרים לכתוש אותה לקראת יום הכיפורים כדי שתהיה דקה מן הדקה. הכתישה מבטאת את איחוד כל חלקיקי הקטורת זה עם זה, והקטורת שנועדה לקודש הקודשים היתה צריכה לבטא אחדות עמוקה יותר.
